Un alelo común de HLA se asocia con el SARS asintomático

Nature volumen 620, páginas 128–136 (2023)Cite este artículo

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Los estudios han demostrado que al menos el 20% de las personas infectadas con SARS-CoV-2 permanecen asintomáticas1,2,3,4. Aunque la mayoría de los esfuerzos globales se han centrado en la enfermedad grave de COVID-19, el examen de la infección asintomática brinda una oportunidad única para considerar las características inmunológicas tempranas que promueven una rápida eliminación viral. En este caso, postulando que la variación en los loci del antígeno leucocitario humano (HLA) puede ser la base de los procesos que median la infección asintomática, inscribimos a 29.947 personas, para quienes se disponía de datos de genotipado HLA de alta resolución, en un estudio basado en teléfonos inteligentes diseñado para rastrear los síntomas de COVID-19. y resultados. Nuestra cohorte de descubrimiento (n = 1428) estuvo compuesta por personas no vacunadas que informaron un resultado positivo en la prueba de SARS-CoV-2. Probamos la asociación de cinco loci HLA con el curso de la enfermedad e identificamos una fuerte asociación entre HLA-B*15:01 y la infección asintomática, observada en dos cohortes independientes. Al sugerir que esta asociación genética se debe a la inmunidad de células T preexistente, mostramos que las células T de muestras prepandémicas de individuos portadores de HLA-B*15:01 eran reactivas al péptido inmunodominante derivado S del SARS-CoV-2 NQKLIANQF. . La mayoría de las células T reactivas mostraban un fenotipo de memoria, eran altamente polifuncionales y presentaban reactividad cruzada con un péptido derivado de los coronavirus estacionales. La estructura cristalina de los complejos peptídicos HLA-B*15:01 demuestra que los péptidos NQKLIANQF y NQKLIANAF (de OC43-CoV y HKU1-CoV) comparten una capacidad similar para ser estabilizados y presentados por HLA-B*15:01. Finalmente, mostramos que la similitud estructural de los péptidos sustenta la reactividad cruzada de las células T con los receptores públicos de células T de alta afinidad, proporcionando la base molecular para la inmunidad preexistente mediada por HLA-B*15:01.

A pesar de algunos informes inconsistentes de los síntomas1, los estudios han demostrado que al menos el 20% de las personas infectadas con el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2) permanecen asintomáticas2,3,4. El examen de la infección asintomática brinda una oportunidad única para considerar la enfermedad temprana y las características inmunológicas que promueven una rápida eliminación viral. Centrarse específicamente en la infección asintomática tiene el potencial de mejorar nuestra comprensión de la patogénesis de la enfermedad y respalda los esfuerzos en curso hacia el desarrollo de vacunas y la identificación de posibles objetivos terapéuticos.

Aún no está claro por qué muchas personas eliminan con éxito la infección sin complicaciones importantes, mientras que otras desarrollan una enfermedad grave, incluso sin factores de riesgo conocidos de resultados graves de COVID-195. Sin embargo, se sabe que la genética del huésped está implicada en respuestas inmunológicas diferenciales a la infección y la progresión de la enfermedad. Desde casi el comienzo de la pandemia mundial se han llevado a cabo numerosos estudios destinados a comprender la base genética de los resultados diferenciales en la COVID-19, incluida la iniciativa multicéntrica Host Genetics Initiative6. Sin embargo, la gran mayoría de estos estudios han examinado las asociaciones genéticas con el curso grave de la enfermedad, principalmente en cohortes hospitalizadas7,8. Como resultado, aunque la mayoría de las personas infectadas con SARS-CoV-2 experimentan un curso leve de la enfermedad o son completamente asintomáticas, muy pocos estudios han examinado la genética en el contexto de cohortes comunitarias prospectivas no hospitalizadas.

La región del antígeno leucocitario humano (HLA) (6p21) es la región genómica humana más polimórfica y médicamente importante. La variación del HLA se ha asociado con cientos de enfermedades y afecciones, incluidas las infecciones. Entre los muchos genes implicados en las respuestas inmunitarias humanas, las variantes de HLA tienen una de las asociaciones más fuertes con las infecciones virales. Por ejemplo, el HLA se asocia con la rápida progresión y el control de la carga viral del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)9, la hepatitis B, la hepatitis C y otras enfermedades infecciosas10. En particular, los alelos HLA de clase I y clase II también se han asociado con el síndrome respiratorio agudo severo causado por el SARS-CoV11,12,13.

Los análisis in silico han señalado al HLA como moléculas relevantes para el riesgo de SARS-CoV-2 y objetivos esenciales para el desarrollo de vacunas14,15,16,17. Por ejemplo, HLA-B*46:01 tiene una baja unión prevista a los péptidos del SARS-CoV-2, lo que sugiere que los individuos que expresan esta molécula pueden ser más vulnerables al COVID-1916, lo que corrobora resultados anteriores que muestran la asociación HLA-B*46:01. con riesgo de SARS12. Por el contrario, se predijo que HLA-B*15:03 protegería contra la COVID-19 al presentar péptidos de SARS-CoV-2 altamente conservados a las células T16. Más recientemente, se demostró que, aunque existe cierta superposición, muchos epítopos del SARS-CoV-2 para las células T CD8+ son HLA específicos16. Hasta la fecha, relativamente pocos estudios han examinado directamente las asociaciones de HLA con la infección, con resultados mixtos y no concluyentes en cohortes relativamente pequeñas18,19,20. Estudios más amplios que se basaron en datos de todo el genoma para imputar el HLA no encontraron asociaciones sólidas con la enfermedad7,21; sin embargo, estos estudios se centraron principalmente en pacientes hospitalizados con un curso grave de la enfermedad.

Comprender el impacto de la variación del HLA en la enfermedad promete proporcionar conocimientos significativos que son relevantes para comprender la inmunopatogénesis de la COVID-19, al tiempo que informa sobre el desarrollo de vacunas y posibles inmunoterapias. Aquí presentamos un gran estudio que examina directamente la variación del HLA en el contexto de una enfermedad principalmente leve. Invitamos a donantes voluntarios de médula ósea, de quienes ya se disponía de datos de genotipado HLA de alta resolución, a participar en el Estudio de ciencia ciudadana COVID-19, un estudio basado en teléfonos inteligentes diseñado para rastrear los síntomas y resultados de COVID-19, incluidos los positivos autoinformados. pruebas para la infección por SARS-CoV-2, para desarrollar una cohorte prospectiva que actualmente comprende casi 30.000 personas, así como dos cohortes independientes adicionales. Contextualizamos aún más nuestros hallazgos examinando la reactividad de las células T, el repertorio de receptores de células T, la afinidad y las implicaciones estructurales para las asociaciones HLA observadas. Nuestros resultados respaldan firmemente el papel del HLA clase I en la eliminación viral que conduce a una infección asintomática entre personas con infección por SARS-CoV-2 y brindan un marco importante para estudios adicionales destinados a revelar las bases inmunológicas y genéticas para la recuperación del SARS-CoV. -2 infección.

Nuestra cohorte final estuvo compuesta por 1.428 personas que informaron una prueba positiva para la infección activa por SARS-CoV-2 y se identificaron como blancas. Los datos demográficos básicos de todos los individuos se proporcionan en la Tabla de datos ampliados 1. La lista completa de enfermedades y afecciones reportadas y su frecuencia en esta cohorte se proporciona en la Tabla complementaria 1. Para identificar si la variación de HLA afecta la probabilidad de que un individuo permanezca asintomático después del SARS- Infección por CoV-2, analizamos datos de genotipado de alta resolución para cinco genes HLA de clase I y clase II altamente polimórficos (HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DQB1).

Encontramos que el alelo HLA-B*15:01 estaba significativamente sobrerrepresentado en individuos asintomáticos en relación con individuos sintomáticos (frecuencia = 0,1103 versus 0,0495, odds ratio (OR) = 2,38, intervalo de confianza (IC) del 95 % = 1,51–3,65, P = 3 × 10−5, P corregida por Bonferroni (Padj) = 0,002). Ningún otro alelo HLA en ningún locus se asoció significativamente después de la corrección para comparaciones múltiples. Las frecuencias alélicas para todos los loci se proporcionan en la Tabla complementaria 2.

Para ajustar el efecto de las condiciones comórbidas, así como las diferencias de sexo y edad, ajustamos una serie de modelos de regresión pero no encontramos ningún efecto de las comorbilidades informadas por los pacientes sobre la probabilidad de enfermedad asintomática. Por lo tanto, nuestro modelo final se ajustó solo por edad y sexo, mostrando nuevamente una asociación significativa de HLA-B*15:01 con infección asintomática después del ajuste por estas variables (OR = 2,40, IC del 95 % = 1,54–3,64, P = 5,67 × 10−5, Padj = 0,003; Tabla 1).

Finalmente, observamos un fuerte efecto aditivo para el genotipo asociado. Los individuos que portan dos copias de HLA-B*15:01 tienen más de ocho veces más probabilidades de permanecer asintomáticos que los individuos que portan otros genotipos (OR = 8,58, IC del 95 % = 1,74–34,43, P = 0,001). En general, uno de cada cinco individuos (20%) que permanecieron asintomáticos después de la infección portaban HLA-B*15:01, en comparación con el 9% entre los pacientes que informaron síntomas.

Para comprender si alelos HLA adicionales podrían interactuar con HLA-B*15:01 en una infección asintomática, probamos todos los haplotipos de dos locus por pares que contienen HLA-B. En general, se encontró que las asociaciones haplotípicas para HLA-B~HLA-DRB1 y HLA-A~HLA-B eran significativas en P = 0,01. Al examinar haplotipos alélicos específicos, estas asociaciones fueron impulsadas por dos haplotipos HLA-B*15:01: HLA-B*15:01~HLA-DRB1*04:01 y HLA-A*02:01~HLA-B*15: 01 (Tablas complementarias 3 y 4).

Después de ajustar por sexo y edad, solo la combinación de HLA-B*15:01 y HLA-DRB1*04:01 permaneció significativa después de la corrección para comparaciones múltiples (P = 3 × 10−4, Padj = 0,01). Encontramos un OR para esta combinación (OR = 3,17; IC del 95 % = 1,65–5,80) que excede el de HLA-B*15:01 solo, lo que sugiere que, aunque no se asocia significativamente con la infección asintomática por sí sola en esta cohorte , el alelo de clase II HLA-DRB1*04:01 potencia el efecto de HLA-B*15:01.

Para confirmar nuestros hallazgos, examinamos dos cohortes independientes de pacientes con ascendencia europea. Primero realizamos un nuevo análisis de los datos primarios del genotipo HLA en una cohorte del Reino Unido que se informó anteriormente22; HLA-B*15:01 no se examinó con respecto a la infección asintomática debido a su importancia marginal en sus análisis. Al probar solo el alelo de interés, encontramos que HLA-B*15:01 está fuertemente asociado con la infección asintomática en esta cohorte cuando se ajusta por sexo y edad (P = 0,02, OR = 3,56, IC del 95 % = 1,15–10,94). De manera similar a nuestra cohorte de descubrimiento, encontramos que la frecuencia de portadores de HLA-B*15:01 fue del 17 % en individuos asintomáticos en comparación con el 7 % en pacientes sintomáticos (Tabla 1).

A continuación, examinamos la asociación entre HLA-B*15:01 y la infección asintomática en la cohorte combinada prospectiva longitudinal de patogénesis de la respuesta inmune del huésped COVID-19 (CHIRP) de la UCSF y el impacto a largo plazo de la infección con el nuevo coronavirus (LIINC). Aquí, se identificó que 12 de 82 personas con ascendencia europea tenían un curso de enfermedad asintomático. Nuevamente encontramos que la frecuencia de portadores de HLA-B*15:01 fue excepcionalmente alta (25%) en individuos asintomáticos en comparación con los pacientes sintomáticos (8,6%). Aunque el poder fue algo limitado por el tamaño de la muestra y, por lo tanto, no puede considerarse una replicación completamente independiente, los hallazgos tienen una fuerte tendencia que respalda nuestro hallazgo de una fuerte asociación de este alelo con la enfermedad asintomática (P = 0,13, OR = 3,44; IC del 95 % = 0,50 a 23,64; Tabla 1). Finalmente, un metanálisis de los tres conjuntos de datos (Citizen Science, Reino Unido, CHIRP/LIINC) confirmó la fuerte y consistente asociación de HLA-B*15:01 con la infección asintomática (P < 10-4, OR = 2,55, 95 % IC = 1,73–3,77 (figura complementaria 1).

Debido a su alta avidez por sus receptores de células T afines, los tetrámeros pHLA (péptido-HLA) se han utilizado sistemáticamente para visualizar y cuantificar células T específicas de antígeno de baja frecuencia ex vivo mediante citometría de flujo23. Nos centramos en cuatro epítopos del SARS-CoV-2 (CVADYSVLY, HVGEIPVAY, NQKLIANQF y RVAGDSGFAAY) que previamente demostraron provocar inmunidad celular mediada por células T CD8+ citotóxicas en pacientes con COVID-19 portadores de HLA-B*15:01 (refs. 24,25,26,27,28). A continuación, realizamos una evaluación del tetrámero pHLA ex vivo con los péptidos del SARS-CoV-2 para detectar células T CD8+ específicas de antígeno en nueve muestras de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) prepandémicas. Observamos células T tetrámero + CD8 + para tres de los epítopos del SARS-CoV-2 (Fig. 1a, b, Tablas complementarias 5 y 6 y Figuras complementarias 2 y 3).

a – c, El análisis combinatorio de tetrámeros ex vivo para los cuatro péptidos indicados se realizó en nueve muestras de donantes prepandémicas. a,b, Se muestra el número de donantes con células T tetrámero+CD8+ detectables (a) y sus frecuencias (b). c, La proporción de células vírgenes (CD45RA+CCR7+) y de memoria (combinación de CD45RA−CCR7−, CD45RA−CCR7+, CD45RA+CCR7−) entre células T tetrámero+CD8+ (basado en n = 9 muestras). d, Análisis fenotípico después de TAME de tetrámero ex vivo + células T específicas de NQK-Q8 (tet-Q8) y específicas de NQK-A8 (tet-A8) en 7 y 6 donantes, respectivamente. Los tipos de células se definieron de la siguiente manera: Tnaive (CD45RA+CCR7+CD95−); TSCM (memoria de células madre, CD45RA+CCR7+CD95+); TCM (memoria central, CD45RA-CCR7+); TEM (memoria efectora, CD45RA-CCR7-); TEMRA (terminalmente diferenciado, CD45RA+CCR7−). Los datos son media ± sem

NQKLIANQF (en adelante, NQK-Q8) fue detectable en la mayor proporción de muestras (5 de 9; 55,6%). En particular, en esos donantes, el 100% de las células T ex vivo del tetrámero NQK-Q8+CD8+ eran células T de memoria, lo que indica inmunidad de células T preexistente contra el SARS-CoV-2 en un subconjunto de individuos portadores de HLA-B*15:01 que no tuvieron ningún contacto previo con el virus (Fig. 1c y Tabla complementaria 5).

NQK-Q8 se identificó previamente como inmunodominante28, y estos autores también demostraron que las células T específicas de NQK-Q8 de pacientes HLA-B*15:01+ con infección tenían reactividad cruzada con el péptido altamente homólogo NQKLIANAF (en adelante, NQK-A8 ) de los coronavirus estacionales HKU1-CoV y OC43-CoV. Dado el alto nivel de células T de memoria específicas de NQK-Q8 en comparación con las células T CD8 + vírgenes observadas en el conjunto inicial de muestras prepandémicas que analizamos (Fig. 1c), intentamos determinar si también se observó el mismo fenotipo para el péptido NQK-A8 en muestras adicionales de individuos HLA-B*15:01+ sin exposición al SARS-CoV-2. Realizamos enriquecimiento magnético de tetrámeros (TAME) ex vivo con tetrámeros de cada péptido, NQK-Q8 y NQK-A8, unidos a HLA-B*15:01 (tet-Q8 y tet-A8, respectivamente) (Fig. 1d, Ampliado Figuras de datos 1 y 2 y Figura complementaria 4) utilizando un mayor número de muestras adicionales (n = 7 y n = 5 para tet-Q8 y tet-A8, respectivamente). Utilizamos muestras prepandémicas de EE. UU. y Australia según nuestro estudio anterior25. Todas estas muestras exhibieron células T tetrámero+CD8+. En general, observamos células T específicas de NQK-Q8 en el 75% de los donantes HLA-B*15:01+ sin exposición previa al SARS-CoV-2 (n = 12 de 16; Fig. 1a-d y datos ampliados Figura 1).

A continuación, analizamos el fenotipo de las células T tetrámero + CD8 + para ambos péptidos NQK (Fig. 1d). Observamos una abundancia de células T de memoria específicas para NQK-Q8 en muestras prepandémicas (Fig. 1d y Datos ampliados, Fig. 2). Se observó un perfil fenotípico similar para las células T específicas de NQK-A8, siendo la mayoría de las células T tetrámero + CD8 + células de memoria (Fig. 1d y Datos ampliados Fig. 2). La alta proporción de memoria efectora y de memoria efectora que reexpresan células T CD45RA (TEMRA) (29% para NQK-Q8 y 31% para NQK-A8) indica una potente respuesta de células T hacia estos péptidos, que es una característica deseable para la protección. inmunidad. Pudimos detectar células T tetrámero + CD8 + ex vivo para NQK-Q8 (n = 7) y NQK-A8 (n = 6) (Fig. 1d y Datos ampliados Fig. 1). En general, nuestros datos muestran la presencia de células T CD8+ específicas para ambos péptidos NQK, con un fenotipo y magnitud similar en donantes no expuestos.

A continuación, intentamos determinar si la reactividad cruzada de células T observada previamente28 en pacientes con infección podría observarse en individuos no expuestos. Configuramos líneas de células T con cada péptido por separado utilizando PBMC de donantes no expuestos y no vacunados (n = 5, in vitro). Luego se reestimuló cada línea celular con cualquiera de los péptidos. El reconocimiento y la activación de las células T CD8 + se determinaron mediante tinción de tetrámero y tinción de citoquinas intracelulares, respectivamente (Fig. 2a y Fig. 4 complementaria).

a, Producción total de citocinas por células T CD8+ en líneas de células T específicas de NQK-A8 y NQK-Q8. Cada línea de células T específica de péptido se reestimuló individualmente con su péptido afín o el péptido homólogo como se indica, y la respuesta de citocinas se midió mediante tinción con citocinas intracelulares (n = 5 donantes). Se informan los porcentajes de funciones efectoras (IFNγ, TNF, IL-2, MIP-1β, CD107a) menos el control sin péptido. b, Análisis de tetrámeros in vitro para las líneas de células T específicas de NQK-Q8 y NQK-A8 (n = 5 donantes). Las líneas celulares se tiñeron con tetrámero con un único tetrámero tet-A8 (barra naranja) o tet-Q8 (barra violeta) o ambos tetrámeros (barra verde). Se muestra la frecuencia de células T tetrámero+CD8+. Los datos son mediana ± rango intercuartil. Las diferencias entre dos grupos se compararon mediante pruebas t no pareadas de dos colas. P <0,05 se consideró significativo. NS, no significativo. c, Análisis de polifuncionalidad de células T CD8+ específicas del péptido NQK de cinco donantes no expuestos. El número de funciones se muestra en una escala de 5 (negro) a 1 (blanco). Los datos son la frecuencia relativa (%) del total de células T citoquinas+CD8+. Los datos son media ± sem. Las diferencias entre dos grupos se determinaron mediante pruebas t no apareadas de dos colas. Se consideró significativo P < 0,05 y el resultado no fue significativo.

Todas las líneas celulares se caracterizaron por la presencia de células T tetrámero + CD8 + para ambos péptidos (Figura complementaria 5), ​​lo que muestra una reactividad cruzada bidireccional mediante la cual las células T pueden reconocer ambos péptidos NQK derivados de los diferentes virus. La magnitud de las células T tetrámero + CD8 + fue diferente entre los donantes y ligeramente mayor para las líneas celulares generadas con el péptido NQK-A8 (Fig. 2b). La tinción conjunta de las líneas de células T con ambos tetrámeros (tet-Q8, conjugado con aloficocianina (APC); tet-A8, conjugado con ficoeritrina (PE)) mostró que la gran mayoría de las células T tenían reactividad cruzada (Figura complementaria 5). ).

Posteriormente medimos el nivel de capacidad de respuesta de las células T a cada péptido. Las células T de todos los donantes, excepto GR8, respondieron al péptido afín (Fig. 2a). En cuatro de cinco donantes, se observó una respuesta más fuerte en las líneas celulares específicas de NQK-A8 independientemente del péptido (Fig. 2a). Estos hallazgos fueron similares a lo que observamos previamente para los péptidos N(105-113) derivados de SARS-CoV-2 y HKU1-CoV/OC43-CoV, en el contexto de HLA-B*07:02, mediante el cual las células T fueron estimulados más fuertemente después de la presentación del péptido derivado del coronavirus estacional en comparación con el péptido derivado del SARS-CoV-2 en donantes no expuestos25.

En particular, aunque el porcentaje de células T citoquinas + CD8 + fue diferente entre los donantes (alrededor del 0 al 8%; Fig. 2a), el nivel y el perfil de citocinas fueron comparables para cada línea celular entre los dos péptidos. Esta observación sugiere que ambos péptidos NQK estimulan las células T en magnitudes similares, lo que puede reflejar un alto nivel de reactividad cruzada de las células T. Luego examinamos el perfil funcional de las células T CD8 +, que corresponde a su capacidad para exhibir diferentes funciones efectoras (IFNγ, TNF, IL-2, MIP-1β, CD107a; Fig. 2c). Se observó una respuesta de células T altamente polifuncional, con hasta cinco funciones expresadas, para ambas líneas celulares que fueron reestimuladas con cualquiera de los péptidos. Al menos el 40% (n = 2 de 5) y hasta el 80% (n = 4 de 5) de los donantes tenían células T que exhibían las cinco funciones en una o más líneas celulares. Un promedio de 2,5 a 4,7% de las células T CD8+ exhibieron las cinco funciones analizadas (Fig. 2c y Datos ampliados, Fig. 3).

En resumen, la respuesta de las células T contra los péptidos NQK de los coronavirus estacionales y el SARS-CoV-2 en individuos que nunca estuvieron expuestos al SARS-CoV-2 tiene una alta reactividad cruzada y es polifuncional.

A continuación, determinamos el repertorio del receptor de células T (TCR) específico de los péptidos NQK-A8 y NQK-Q8. Utilizando la clasificación unicelular de células T tetrámero + CD8 + y la secuenciación de TCR, obtuvimos 456 secuencias clonotípicas productivas de ocho donantes no expuestos y un donante triplemente vacunado (Tabla complementaria 7). Los repertorios de TCR de células T específicos de cada o ambos péptidos NQK (células T CD8+ de tetrámero simple o doble) se obtuvieron tanto de líneas de células T (in vitro) como de PBMC no estimuladas (ex vivo) (Fig. 3a, b, Tabla complementaria 7, datos ampliados, figuras 4 y 5 y figura complementaria 6).

a,b, Análisis del repertorio de TCR ex vivo para células T específicas de NQK-A8 y NQK-Q8 después de TAME sobre la base del uso de TRBV (a) y TRAV (b). Los gráficos circulares muestran el porcentaje de cada TRBV o TRAV utilizado en los clonotipos ordenados unicelulares. Los motivos de secuencia CDR3β y CDR3α se muestran debajo de los gráficos circulares, respectivamente, para los TCR con la expresión sesgada de TRBV7-2/7-8 emparejada con TRAV9/26 o TRAV21, incluidos los TCR públicos. c, d, La respuesta de unión (unidades de respuesta (RU)) de los TCR (analito) D5A (c) y D9A (d) contra los complejos HLA-B*15:01-NQK (A8 en naranja y Q8 en morado). El TCR público D5A expresa TRBV7-2 emparejado con TRAV21, y el TCR público D9A expresa TRBV7-2 emparejado con TRAV9-2; Las secuencias de CDR3β y CDR3α para cada TCR público se muestran debajo de las curvas de unión. Las curvas de unión de SPR en estado estacionario representan la unión en un rango de concentración de TCR de 0,39 a 100 μM. n = 2 experimentos biológicamente independientes realizados por duplicado; el gráfico muestra los resultados de un experimento realizado por duplicado, representado por los puntos negros.

Los repertorios de TCR específicos de NQK se superponen ampliamente con los clonotipos compartidos y los TCR públicos (Tablas complementarias 7 y 8). El repertorio de TCR ex vivo estaba fuertemente sesgado con clonotipos que expresaban TRAV9 (31%) o TRAV21 (15%) emparejados con el TRBV7-2/7-8 dominante (71%) (Fig. 3a, b y Tabla complementaria 7). Aunque los clonotipos TRBV7-2/7-8 también estuvieron presentes en el repertorio in vitro, su frecuencia disminuyó (11%); También observamos la expansión de los clonotipos TRBV5-4/5-8+ (35%), TRBV9+ (18%) y TRBV20-1+ (24%). De manera similar, se observó un cambio de frecuencia para el uso del gen TRAV en el repertorio de TCR in vitro con una disminución en los clonotipos TRAV21+ (6%), una ausencia de clonotipos TRAV9+ y la aparición de TRAV19+ (21%), TRAV38-2/DV8*. Clonotipos 01+ (19%) y TRAV41+ (47%). Los clonotipos TRAV38-2/DV8*01+ y TRAV41+ se expandieron en un solo donante cada uno (GR81 y GR80, respectivamente), y estos se emparejaron solo con TRBV20-1 y TRBV5-4/5-8, respectivamente; Estos clonotipos expandidos tuvieron reactividad cruzada (Tabla complementaria 7). Las células T CD8+ capaces de unirse tanto a tet-A8 como a tet-Q8 expresaron principalmente TRBV7-2/7-8 (42%) emparejado con TRAV21 (54%); TRBV9 (36%, emparejamiento desconocido); o TRBV5-4/5-8 (12%) combinado con TRAV41 (36%) (Tabla complementaria 7). Además, los motivos de secuencia y longitud del bucle CDR3 compartían similitudes (Fig. 3 y Datos ampliados, Fig. 5). También se aislaron los TCR públicos, definidos como TCR idénticos compartidos entre individuos29. Los TCR públicos específicos de NQK fueron TRBV7-2/7-8+ emparejados con TRAV21 o TRAV9-2 y se observaron tanto ex vivo como in vitro en donantes no expuestos (Fig. 3c, d y Tabla complementaria 8). Estos TCR públicos y de reacción cruzada también se han aislado de donantes que se habían recuperado de COVID-19 y/o de donantes vacunados previamente28 (Tabla complementaria 8). Este hallazgo muestra el potencial de un fuerte conjunto de memoria inmune preexistente de TCR públicos con reacción cruzada específicos de los péptidos NKQ que es similar al observado después de la infección. Los perfiles fenotípicos de los clonotipos que expresan los TCR públicos ex vivo en donantes no expuestos eran células T de memoria madre o de memoria central.

En resumen, los repertorios de TCR específicos de NQK-Q8 y NQK-A8 están sesgados con la presencia de TCR públicos y de reacción cruzada en donantes no expuestos, comparable a las observaciones en donantes que se han recuperado de COVID-19 y/o donantes vacunados ( Figuras complementarias 6 y 7). Estos hallazgos sugieren que la existencia de TCR específicos de NQK con reacción cruzada de memoria antes de la infección podría tener un papel crítico en la respuesta inmune al SARS-CoV-2, contribuyendo a la infección asintomática en individuos portadores de HLA-B*15:01.

El péptido NQK-Q8 restringido a HLA-B*15:01 se conserva entre todas las variantes del SARS-CoV-2, incluso la nueva variante XBB de Omicron, y difiere solo en un aminoácido del péptido HKU1-CoV/OC43-CoV. (Figura complementaria 8). Es importante destacar que anteriormente se demostró que las células T reactivas a NQK-Q8 de individuos HLA-B*15:01+ infectados con SARS-CoV-2 tenían reactividad cruzada con el péptido homólogo de los coronavirus estacionales28. Como hemos demostrado la presencia de inmunidad de células T preexistente en muestras prepandémicas y la reactividad cruzada de las células T específicas del péptido NQK (Figs. 1 y 2), intentamos investigar si el cambio de aminoácidos en la proteína NQK Los péptidos del SARS-CoV-2 y los coronavirus estacionales HKU1-CoV y OC43-CoV afectan la estabilidad de HLA-B*15:01.

Replegamos la molécula HLA-B*15:01 en presencia de cada péptido y realizamos un ensayo de fusión térmica utilizando fluorimetría de barrido diferencial (DSF). Ambos complejos de pHLA exhibieron el mismo punto de fusión térmica (Tm; Fig. 4a y Tabla complementaria 9), lo que indica que el cambio de aminoácidos Gln>Ala no afecta la estabilidad general del pHLA. Cristalizamos cada péptido en un complejo con HLA-B*15:01 y resolvimos sus estructuras en alta resolución (Fig. 4b, Tabla de datos extendidos 2 y Datos extendidos Fig. 6). En general, NQK-Q8 adoptó una conformación canónica dentro de la hendidura de unión al antígeno de la molécula HLA-B*15:0130. El Gln en la posición 2 (P2) se insertó profundamente en el bolsillo B de HLA-B*15:01, mientras que el residuo de anclaje primario P9-Phe se unió al bolsillo F. La parte central era más móvil que el resto del péptido (Datos ampliados, Fig. 6). El péptido NQK-Q8 expuso al disolvente, y potencialmente a las células T circulantes, cinco de sus nueve residuos (P1-Asn, P4-Leu, P6-Ala, P5-Asn y P8-Gln). El péptido NQK-A8 se unió de manera similar en la hendidura HLA-B*15:01 (Fig. 4b y Datos ampliados, Fig. 6). La superposición de las dos estructuras de pHLA reveló muy poca diferencia entre los dos complejos, con una desviación cuadrática media de 0,08 Å para los átomos de Cα de la hendidura de unión al antígeno (residuos 1 a 180) y 0,12 Å para los péptidos. Solo se observó cierta reordenación local alrededor del P8 del péptido con un desplazamiento de la cadena lateral Glu76 para evitar choques estéricos con el P8-Gln (Fig. 4b). Este cambio, que se produce en la superficie del péptido, podría afectar la interacción de las células T y podría cambiar la afinidad del TCR. Para probar el efecto de la diferencia de P8 dentro de los péptidos NQK, seleccionamos algunos TCR representativos para realizar mediciones de afinidad utilizando resonancia de plasmón superficial (SPR). Seleccionamos los tres TCR públicos TRBV7-2+ emparejados con TRAV9-2 (D9A TCR) o TRAV21 (A6A y D5A TCR) (Fig. 3c, d y Tabla complementaria 8).

a, gráficos DSF que muestran la intensidad de fluorescencia normalizada frente a la temperatura para HLA-B*15:01 en un complejo con el péptido NQK-Q8 (púrpura) o NQK-A8 (naranja) medido en concentraciones de 5 μM y 10 μM. n = 2 experimentos biológicamente independientes realizados por duplicado, representados por las diferentes líneas. b, Superposición de las estructuras cristalinas de HLA-B*15:01 (caricatura blanca) en un complejo con el péptido NQK-Q8 (barra morada) o NQK-A8 (barra naranja).

Todos los TCR probados pudieron unirse con alta afinidad (rango de Kd, 6–20 μM) a los péptidos NQK-A8 y NQK-Q8 presentados por la molécula HLA-B*15:01 (Fig. 3c, d, Datos ampliados, figuras 7 y 8 y tabla complementaria 10). Observamos una tasa de disociación más lenta para los dos TCR TRAV21+ (TCR A6A y D5A) en comparación con el TCR TRAV9+ D9A (Datos ampliados, figura 7). Los TCR también difieren en sus bucles CDR3β.

En un estudio anterior28, se demostró la reactividad cruzada de dos TCR específicos de NQK-Q8 (TCR1 y TCR2) transfectados en células Jurkat. Los TCR1 y TCR228 publicados difieren en solo un residuo en cada bucle CDR3 de los TCR A6A y D5A, respectivamente (Tabla complementaria 8). Esto se refleja en la afinidad similar de los TCR A6A y D5A por los péptidos NQK-A8 y NQK-Q8 observados aquí (Tabla complementaria 10). En general, nuestros datos muestran que la conformación similar y la capacidad para estabilizar la molécula HLA-B*15:01 de los dos péptidos NQK sustentan la afinidad similar observada para los TCR públicos. Además, la alta afinidad de estos TCR hacia los péptidos NQK podría desencadenar una rápida expansión de estas células de memoria después de la infección por SARS-CoV-2.

Comprender el fundamento biológico de la infección asintomática por SARS-CoV-2 tiene implicaciones importantes para las medidas de salud pública, el diseño de vacunas y el desarrollo terapéutico. Aquí proporcionamos evidencia de una base genética y la explicación mecanicista subyacente a la enfermedad asintomática. Aprovechando una gran base de datos y tecnología móvil en este estudio colaborativo, revelamos importantes conocimientos sobre los fundamentos inmunogenéticos de la infección asintomática por SARS-CoV-2. Nuestro uso de una aplicación móvil y una base de datos preexistente para la investigación médica nos permitió examinar a casi 30.000 personas a las que previamente se les realizó un genotipo de HLA para detectar infecciones virales y el curso de la enfermedad. Aumentamos nuestros hallazgos de una fuerte asociación de HLA con el curso asintomático de la enfermedad en esta cohorte única con estudios funcionales y estructurales para respaldar un modelo de inmunidad preexistente para explicar la asociación de HLA observada.

Mostramos que, entre los participantes que informaron un resultado positivo en la prueba para SARS-CoV-2, HLA-B*15:01 se asocia significativamente con una infección asintomática. Observamos que los individuos que portan este alelo común (aproximadamente el 10% en individuos con ascendencia europea) tienen más del doble de probabilidades de permanecer asintomáticos después de la infección por SARS-CoV-2 en comparación con aquellos que no lo tienen, y un efecto notable de HLA-B* 15:01 la homocigosidad aumenta más de ocho veces la probabilidad de permanecer asintomático. Esto sugiere características importantes de la infección temprana por SARS-CoV-2. Para respaldar el papel de HLA-B*15:01 en la mediación de la infección asintomática, encontramos una distribución de frecuencia muy similar de este alelo en pacientes asintomáticos versus sintomáticos en dos cohortes independientes.

A pesar de un número creciente de estudios publicados, el papel de la variación del HLA en la COVID-19 sigue sin estar claro, sin un consenso claro en la literatura hasta la fecha y, en particular, pocos estudios que examinen la infección asintomática como fenotipo primario18. Nuestro nuevo análisis de los datos primarios que subyacen a una asociación reportada entre HLA-DRB1*04:01 y la infección asintomática22 descubrió evidencia clara del papel de HLA-B*15:01 en la enfermedad asintomática, que no se informó en el estudio inicial. Aunque los datos de nuestra cohorte de descubrimiento no corroboraron la asociación para HLA-DRB1*04:01 solo, encontramos que este alelo mejoraba el efecto de HLA-B*15:01 cuando el par estaba en combinación. Tenga en cuenta que este es el alelo HLA-DRB1 que se asocia más comúnmente con HLA-B*15:01 en individuos en los Estados Unidos que se autoidentifican como blancos31 y, por lo tanto, es difícil diferenciar un efecto real de uno relacionado con el desequilibrio de ligamiento. entre estos loci a menos que se prueben directamente. De manera similar, otro artículo reciente que describe una asociación de alelos HLA-DRB1 con infección asintomática no genotipificó HLA-B32. Finalmente, otros dos grandes estudios que utilizaron cuestionarios de pacientes sobre los síntomas no consideraron los síntomas más leves que son comunes en la infección por SARS-CoV-2 (por ejemplo, secreción nasal y picazón en la garganta), lo que resultó en una definición mucho menos estricta de infección asintomática que la consideramos aquí33,34.

Las infecciones del tracto respiratorio son un importante problema de salud pública y representan una carga sustancial, especialmente para los niños pequeños y los ancianos35,36. Cuatro cepas de coronavirus estacionales (229E-CoV, NL63-CoV, OC43-CoV y HKU1-CoV) representan entre el 15% y el 30% de todas las infecciones del tracto respiratorio cada año37. En particular, estudios anteriores han demostrado que las células T pueden tener una reacción cruzada con el SARS-CoV-2 y los péptidos del coronavirus estacional, lo que indica que la inmunidad protectora duradera de las células T puede limitar potencialmente la gravedad de la COVID-1925. Además, un estudio reciente28 demostró reactividad cruzada de células T con el SARS-CoV-2 y los coronavirus estacionales para un epítopo inmunodominante restringido a HLA-B*15:01 (NQK-Q8) en personas que recibieron dos dosis de Pfizer-BioNTech BNT162b2. Vacuna de ARNm. Para probar la hipótesis de que HLA-B*15:01 puede mediar en la enfermedad asintomática a través de la inmunidad de células T preexistente, analizamos epítopos inmunodominantes en células T de PBMC humanas de individuos sanos prepandémicos. Observamos que las células T de un subconjunto de donantes sanos que portaban HLA-B*15:01 y que nunca estuvieron expuestos al SARS-CoV-2 reaccionaban al péptido NQK-Q8 del SARS-CoV-2, y la mayoría de las células reactivas mostraban un fenotipo de memoria. La identidad de secuencia entre los péptidos del SARS-CoV-2 y los coronavirus estacionales, excepto por una única sustitución de aminoácidos, podría explicar la reactividad cruzada de las células T. Sin embargo, fue necesaria una demostración directa de que los péptidos del SARS-CoV-2 y los coronavirus estacionales OC43-CoV y HKU1-CoV son estables en la hendidura HLA-B*15:01 para corroborar aún más nuestra hipótesis.

Mediante nuestro examen de las estructuras cristalinas de la molécula HLA-B*15:01 en presencia de cada péptido, demostramos que tanto NQK-Q8 (SARS-CoV-2) como NQK-A8 (OC43-CoV y HKU1-CoV ) los péptidos de pico comparten una capacidad similar para estabilizar la molécula HLA-B*15:01 y HLA-B*15:01 los presenta en una conformación similar, lo que proporciona la base molecular para la reactividad cruzada de las células T y la inmunidad preexistente. . Esta observación concuerda con investigaciones previas en individuos HLA-B*07:02+ no infectados que son capaces de reconocer el péptido N(105-113) derivado del SARS-CoV-2 debido a la presencia de células T con reacción cruzada que reconocen el péptido N(105-113) homólogo de OC43-CoV y HKU1-CoV25. En particular, esta reactividad cruzada de células T se ha asociado con una enfermedad COVID-19 menos grave38.

Nuestros datos muestran que los péptidos NQK derivados del coronavirus tanto estacional como pandémico pueden conducir a una respuesta de células T altamente polifuncional en el contexto de HLA-B*15:01, con células T capaces de exhibir diferentes funciones efectoras (IFNγ, TNF, IL- 2, MIP-1β, CD107a). La polifuncionalidad de las células T es crítica ya que puede conducir a una actividad supresora viral superior39,40; está relacionado con TCR de alta afinidad que pueden detectar niveles bajos de antígenos39,41 y predice la inmunidad protectora y la eficacia de la vacuna42,43,44. El alto nivel de polifuncionalidad observado para las células T CD8+ hacia el péptido NQK-Q8 en individuos no expuestos contrasta con la polifuncionalidad moderada observada para el péptido N(105-113) del SARS-CoV-2 restringido a HLA-B*07:02 ( SPRWYFYYL) que también comparte una alta similitud de secuencia con el péptido OC43/HKU-1-CoV N(105-113) (LPRWYFYYL)25. Aunque se observó cierto uso sesgado del gen TCR en el repertorio de TCR específico de HLA-B*07:02-N(105-113), no observamos la presencia de TCR públicos25. Por el contrario, observamos que el repertorio de TCR específico de HLA-B*15:01-NQK se caracterizaba por la existencia de TCR públicos. El fenotipo de memoria de los TCR públicos en donantes no expuestos también sugiere firmemente que podrían proporcionar una ventaja protectora a los donantes HLA-B*15:01+ infectados por SARS-CoV-2.

La presencia de un alto nivel de células T de memoria, polifuncionales, de alta afinidad y de reacción cruzada pública en donantes no expuestos probablemente sustenta la fuerte asociación entre el alelo HLA-B*15:01 y la infección asintomática por SARS-CoV-2. La presencia de TCR públicos con reactividad cruzada antes de la infección, observada también después de la infección o la vacunación28, podría proporcionar una respuesta inmune rápida y protectora en individuos portadores de HLA-B*15:01. Esta característica podría hacer que el HLA-B*15:01 sea un alelo generalmente más protector que el HLA-B*07:02, que se ha descrito como potencialmente limitante de la gravedad de la enfermedad COVID-1938. Nuestros resultados también muestran la importancia de que la inmunidad preexistente25,28,45,46 dé lugar a un conjunto de memoria de células T con reacción cruzada listas para combatir la infección23,37.

El examen de las células T en pacientes con infección asintomática por SARS-CoV-2 ha sugerido respuestas sólidas de las células T similares a las de aquellos con enfermedad sintomática47. Estudios recientes han demostrado que las células T de memoria específicas del SARS-CoV-2 están enriquecidas en el lugar de la infección en comparación con la sangre48. Por lo tanto, las bajas frecuencias de las células T de memoria que observamos en la sangre son probablemente una representación insuficiente de las células T de memoria específicas de antígeno residentes en el tracto respiratorio que responden rápidamente a la reestimulación del antígeno en los sitios de entrada viral. Presumiblemente, una población de células T de memoria residente preexistente en los sitios de entrada viral puede conducir a una rápida eliminación viral antes de la aparición manifiesta de los síntomas. Además, el hallazgo de que las células T en la infección asintomática secretan mayores cantidades de IFNγ en comparación con las de los pacientes sintomáticos en las primeras etapas de la infección44,47 respalda el papel de las células T de memoria en esta etapa49. Aunque la literatura actual es mixta con respecto a las células T CD8+ con reactividad cruzada específicas del SARS-CoV-2, esto podría explicarse por la especificidad del HLA50,51.

En conjunto, nuestros resultados respaldan firmemente la hipótesis de que HLA-B*15:01 media la enfermedad COVID-19 asintomática a través de inmunidad de células T preexistente debido a la exposición previa a HKU1-CoV y OC43-CoV. En particular, el péptido NQK-Q8 se conserva entre las variantes del SARS-CoV-2; Además, entre todos los epítopos de células T derivados del SARS-CoV-2 restringidos a HLA-B15:01 informados en la base de datos de epítopos inmunes (Figura 8 complementaria), ningún otro epítopo exhibe una alta identidad de secuencia en los coronavirus comunes, excepto la poliproteína replicasa. 1ab péptido QLYLGGMSY. Sin embargo, este último epítopo no ha sido reportado en la literatura como inmunodominante en pacientes positivos para HLA-B*15:01 y SARS-CoV-2. Sobre la base de los datos limitados disponibles sobre los epítopos conocidos de HLA-B*15:01 en pacientes con SARS-CoV-2, NQK-Q8 sigue siendo el principal péptido candidato subyacente a cualquier inmunidad cruzada de células T mediada por HLA-B*15:01. con coronavirus estacionales.

Una limitación de este estudio es que todos los resultados de las pruebas y los síntomas en nuestra cohorte de descubrimiento son autoinformados. Reconocemos que esto puede dar lugar a cierto margen de error en nuestros resultados. Sin embargo, previamente hemos validado este enfoque verificando los resultados de las pruebas en un subconjunto de participantes52. De manera similar, no consultamos algunos síntomas, en particular los relacionados con erupción cutánea y congestión nasal simple (a diferencia de la secreción nasal, que consideramos aquí), y no consideramos como sintomáticos a los individuos con un solo informe de síntomas dentro de nuestro período de dos semanas. , lo que puede haber dado lugar a que algunas personas fueran categorizadas como asintomáticas cuando en realidad experimentaron síntomas leves. Sin embargo, incorporamos una "verificación de cordura" adicional en nuestra clasificación de enfermedades asintomáticas, donde consideramos la respuesta a la pregunta de la encuesta sobre sus motivos para buscar pruebas de infección por SARS-CoV-2. Por lo tanto, aunque nuestra metodología de autoinforme significa que no podemos afirmar definitivamente que nuestra cohorte asintomática estaba completamente libre de cualquier síntoma (y en algunos casos puede, más bien, considerarse levemente sintomática), confiamos en que nuestra clasificación de individuos como asintomáticos fue generalmente robusto. Es importante destacar que encontramos una asociación genética muy consistente en todo el estudio y en dos cohortes independientes donde la enfermedad asintomática fue definida por el médico, lo que apunta a una verdadera característica biológica.

Otra limitación es que los resultados de nuestra asociación se limitan a personas que se autoidentifican como blancas. Si bien nuestras cohortes de estudio no tenían suficiente información a este respecto, encontramos que nuestros resultados para HLA-B*15:01 parecen tener una tendencia similar en individuos negros, aunque este resultado es menos claro en individuos asiáticos e hispanos (Tabla complementaria 11). . Sin embargo, debido a la escasez de individuos combinada con la menor frecuencia de este alelo en algunas poblaciones, es imposible concluir si nuestros resultados para la asociación HLA-B*15:01 con enfermedad asintomática son aplicables en estos ancestros. Una última limitación es que probamos sólo cuatro péptidos del SARS-CoV-2 en nuestro análisis ex vivo. La búsqueda de péptidos candidatos adicionales se verá facilitada a medida que más estudios analicen la reactividad de las células T en pacientes portadores de HLA-B*15:01, de forma similar a un estudio anterior28. Sin embargo, identificamos al menos un péptido del SARS-CoV-2 que previamente se sabía que era inmunodominante en la infección por SARS-CoV-2 y que reaccionaba a las células T de memoria de individuos HLA-B*15:01+ recolectados antes de la pandemia.

En resumen, hemos demostrado una asociación fuerte y significativa de un alelo HLA de clase I común, HLA-B*15:01, con la infección asintomática por SARS-CoV-2. Demostramos que las células T HLA-B*15:01+ de muestras prepandémicas reaccionaban a un péptido inmunodominante del SARS-CoV-2 que comparte una alta similitud de secuencia con los péptidos de los coronavirus estacionales. Proporcionamos la base molecular de la reactividad cruzada de las células T al mostrar que HLA-B*15:01 puede estabilizar y presentar péptidos de HKU1-CoV y OC43-CoV de manera similar al péptido inmunodominante del SARS-CoV-2. Además, mostramos que los clonotipos públicos tenían reactividad cruzada, eran polifuncionales y podían reconocer ambos péptidos NQK con alta afinidad. Nuestros resultados tienen implicaciones importantes para comprender la infección temprana y el mecanismo subyacente a la eliminación viral temprana y pueden sentar las bases para perfeccionar el desarrollo de vacunas y las opciones terapéuticas en la enfermedad temprana.

Los participantes del estudio fueron donantes voluntarios de médula ósea con direcciones de correo electrónico válidas registradas en el Programa Nacional de Donantes de Médula Ósea (NMDP) que fueron invitados a participar en el estudio a través de una campaña de divulgación por correo electrónico que comenzó en julio de 2020. Todos los individuos tenían dentro La base de datos del NMDP es un registro preexistente para el genotipado de HLA de alta resolución, generalmente para cinco loci (HLA-A, -B, -C, -DRB1 y -DQB1)31. Los participantes que opten por participar en el estudio deben descargar una aplicación para teléfonos inteligentes y participar en el Estudio de ciencia ciudadana COVID-19 (lanzado utilizando la plataforma de investigación digital Eureka; https://eureka.app.link/covid19) o, a partir de enero 2021, participa a través de la página web (https://covid19.eurekaplatform.org/). Una vez inscritos, se pide a los participantes que completen una encuesta inicial de 10 a 15 minutos sobre datos demográficos iniciales, su historial de salud y hábitos diarios. Las preguntas diarias de seguimiento específicas de los síntomas, las preguntas semanales sobre las pruebas y las preguntas mensuales sobre la hospitalización por COVID-19 se envían mediante notificaciones automáticas o mensajes de texto de forma continua y requieren de 5 a 15 minutos por semana. Al 30 de abril de 2021, inscribimos a 29 947 personas, de las cuales 21 893 completaron su encuesta de referencia (Tabla complementaria 12). La participación en el estudio de ciencia ciudadana de la UCSF y la vinculación con los datos de NMDP HLA fueron aprobadas por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de California, San Francisco (IRB 17-21879 e IRB 20-30850, respectivamente). Todos los participantes dieron su consentimiento informado por escrito aceptando la investigación y la publicación de los resultados de la investigación.

Dentro de la aplicación móvil, a los encuestados se les pregunta durante su encuesta inicial de referencia si alguna vez se les ha hecho una prueba de infección activa e informan el resultado (positivo, negativo, no lo sé) y el número aproximado de semanas desde la prueba. A partir de entonces, cada semana se pregunta a los encuestados si se hicieron la prueba la semana anterior y que informen el resultado. Consideramos que cualquier persona que informara una prueba positiva de infección activa había sido infectada con SARS-CoV-2. Nuestra cohorte estuvo formada por personas que informaron una prueba positiva para el virus hasta el 30 de abril de 2021 antes de la implementación de la vacunación generalizada contra el virus. Restringimos el análisis a personas que se habían autoidentificado como "blancas" solo debido a que no había suficientes números para el análisis en los otros grupos (Tablas complementarias 13 y 14), lo que permitió un análisis de 1.428 personas. Los criterios de inclusión se proporcionan en la figura complementaria 9.

Los síntomas son autoinformados al inicio y en encuestas diarias. Dentro de la encuesta de referencia, se pide a los encuestados que informen si tuvieron alguno de una lista de síntomas (Tabla complementaria 15) durante 3 días o más en cualquier momento desde febrero de 2020. Estos mismos síntomas se preguntan en cada encuesta diaria, donde los encuestados son Se les preguntó si habían experimentado cada síntoma en las 24 h anteriores. Entre esos individuos, consideramos asintomáticos a aquellos que informaron haber tenido una prueba positiva para virus activo en la línea de base, con un tiempo desde la prueba de más de 2 semanas o que no especificaron fechas de prueba, y que informaron "Ninguna de las anteriores". ”para todos los síntomas en la encuesta de referencia. También consideramos los informes de síntomas diarios durante las 2 semanas posteriores a la línea de base para los encuestados que informaron que una prueba positiva para infección activa en la línea de base había ocurrido dentro de las 2 semanas anteriores. En estos casos, consideramos a los individuos asintomáticos si, además de no informar síntomas al inicio del estudio, no informaron ningún síntoma dos o más veces dentro de este período de tiempo. Para las personas que no informaron una prueba positiva para infección activa al inicio del estudio, pero posteriormente informaron una prueba positiva en una encuesta semanal, utilizamos los mismos criterios considerando los informes de síntomas diarios para el período de 2 semanas antes y 2 semanas después del informe de prueba positiva. (Figura complementaria 10). Para confirmar aún más la falta de síntomas, también consideramos la pregunta de la encuesta "¿Por qué se realizó la prueba de infección (virus) activa de COVID-19?" (Tabla complementaria 16). Las personas que de otro modo no informaron síntomas, pero respondieron "Tenía síntomas relacionados con la infección por COVID-19" fueron categorizadas como sintomáticas.

Los participantes del estudio se inscribieron en dos cohortes longitudinales prospectivas basadas en la UCSF: el estudio CHIRP y el estudio LIINC. Los participantes fueron identificados a través de sistemas clínicos locales (UCSF Moffitt Hospital, San Francisco General Hospital, Kaiser, California Pacific Medical Center), así como del Departamento de Salud Pública de San Francisco. Después de la confirmación de los resultados de la prueba o la exposición al SARS-CoV-2 para determinar la elegibilidad, se pidió a los participantes que firmaran un formulario de consentimiento, completaran una visita inicial y programaran visitas de seguimiento en persona. El estudio CHIRP incluyó voluntarios con documentación de prueba de PCR positiva y/o inicio de síntomas en los 21 días anteriores. La enfermedad asintomática se definió como tener una prueba de PCR positiva confirmada sin ningún síntoma (“¿Tuvo o todavía tiene algún síntoma que cree que se debe a COVID-19?”) en las visitas iniciales y de seguimiento. Se recogieron un total de cinco muestras longitudinales de participantes con infección aguda por SARS-CoV-2. La primera muestra se recopiló <31 días desde la aparición de los síntomas o <31 días desde la exposición al SARS-CoV-2 como una visita inicial de la semana 0. Las muestras restantes se recolectaron en las semanas 1, 3, 10 y 24. En cada visita CHIRP, se recolectaron sangre y hisopos nasofaríngeos. La recolección de muestras opcional incluyó esputo, saliva, heces y orina. El estudio LIINC inscribió a participantes con infección previa por SARS-CoV-2 confirmada mediante pruebas clínicas de amplificación de ácido nucleico entre 14 y 90 días después de la aparición de los síntomas iniciales. Después del consentimiento informado por escrito, los datos clínicos y las bioespecímenes se recolectaron mensualmente durante hasta 4 meses después de la aparición de los síntomas iniciales y luego cada 4 meses a partir de entonces. En cada visita se recogieron muestras biológicas, incluidas sangre y saliva. CHIRP y LIINC utilizaron un conjunto armonizado de formularios de informe de casos para recopilar datos clínicos sobre demografía, historial médico, la enfermedad de COVID-19 y síntomas posagudos. Las mediciones clínicas recopiladas durante las visitas CHIRP en persona incluyeron hemograma completo con diferencial, panel metabólico completo, velocidad de sedimentación globular, proteína C reactiva de alta sensibilidad, dímero D, lactato deshidrogenasa y ferritina. Todos los participantes dieron su consentimiento informado por escrito aceptando la investigación y la publicación de los resultados de la investigación, y los estudios CHIRP y LIINC fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de California, San Francisco (IRB 20-30588 y 20-30479, respectivamente). .

Se fragmentó un total de 100 ng de ADN de alta calidad utilizando el kit de fragmentación enzimática de preparación de bibliotecas 2.0 (Twist Bioscience). Posteriormente, se repararon los extremos del ADN fragmentado, se agregaron colas de poli(A) y se ligaron mediante PCR a adaptadores de índice dual compatibles con Illumina que tenían códigos de barras únicos. Después de la ligación, los fragmentos se purificaron con una proporción de 0,8 x perlas magnéticas AMPure XP (Beckman Coulter), seguido de una selección de doble tamaño (proporciones de 0,42 x y 0,15 x) para seleccionar bibliotecas de aproximadamente 800 pb. Finalmente, las bibliotecas se amplificaron y purificaron con perlas magnéticas.

Después de la cuantificación fluorométrica, se combinaron con precisión 30 ng de cada muestra utilizando energía acústica ultrasónica y la captura dirigida se realizó utilizando el kit Twist Target Enrichment (Twist Bioscience). En resumen, los volúmenes se redujeron utilizando perlas magnéticas y las bibliotecas de ADN se unieron a 1.394 sondas biotiniladas específicas de la región HLA, que cubren todos los exones, intrones y regiones reguladoras de HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA- DRB1, HLA-DRA, HLA-DQB1, HLA-DQA1, HLA-DPB1 y HLA-DPA1. Los fragmentos a los que apuntaban las sondas se capturaron utilizando perlas magnéticas de estreptavidina y luego se amplificaron y purificaron. Las bibliotecas enriquecidas se analizaron utilizando el BioAnalyzer (Agilent) y se cuantificaron mediante PCR digital de gotitas. Finalmente, las bibliotecas enriquecidas se secuenciaron utilizando la plataforma NovaSeq (Illumina) con un protocolo de secuenciación de 150 pb de extremos emparejados. Después de la secuenciación, los datos se analizaron utilizando HLA Explorer v.1.4 (Omixon) y AlloSeq Tx V471 (CareDx).

Volvimos a analizar los datos primarios de un estudio anterior22 que analizó los genes HLA clase I y clase II en 147 individuos de ascendencia europea con infección conocida por SARS-CoV-2 y una variedad de síntomas y 69 trabajadores hospitalarios asintomáticos. En la publicación inicial, no se analizó directamente la asociación del HLA-B*15:01 con el curso asintomático de la enfermedad. Los métodos de genotipado de HLA, las frecuencias de alelos, los datos demográficos y los resultados clínicos son los descritos anteriormente.

En nuestra cohorte de descubrimiento, examinamos la asociación de cinco loci HLA (HLA-A, -B, -C, -DRB1 y -DQB1) con infección asintomática versus sintomática. El análisis de datos incluyó los dos primeros campos del nombre del alelo como se describe en la nomenclatura HLA, que representa la molécula completa en la resolución de la secuencia polipeptídica.

Las pruebas iniciales para las asociaciones de HLA se realizaron utilizando el paquete R BIGDAWG53, que maneja datos de HLA multialélicos para probar la asociación en los niveles de haplotipo, locus, alelo y aminoácidos. A continuación, utilizamos un modelo lineal generalizado utilizando glm en el paquete base R (v.4.3) para considerar las covariables relevantes, incluidas las comorbilidades informadas, el sexo y la edad, para los alelos que inicialmente se encontraron asociados con una infección asintomática después de la corrección de múltiples pruebas. Corregimos los valores de P utilizando el método Bonferroni54 para el número de alelos probados en HLA-A, -B y -DRB1, lo que explica el fuerte desequilibrio de vinculación entre algunos de los loci probados. Para las cohortes de replicación, probamos solo el alelo de interés, utilizando el marco del modelo lineal generalizado como se describe. El metanálisis de los resultados en nuestras tres cohortes se realizó en R utilizando el modelo de efectos comunes con el metapaquete (v.6.2-1)55.

Los cuatro péptidos del SARS-CoV-2 (Fig. 1a-c y Tabla complementaria 17) se sintetizaron mediante transcripción y traducción in vitro de oligonucleótidos que codifican cada péptido utilizando el kit de síntesis de proteínas in vitro PURExpress (New England BioLabs) como se describió anteriormente56. Los péptidos NQK-Q8 (NQKLIANQF) y NKQ-A8 (NQKLIANAF) (usados ​​en las figuras 1d y 2-4) se sintetizaron utilizando el método de fluoren-9-ilmetoxicarbonilo (Fmoc) de síntesis de péptidos en fase sólida. El proceso se realizó utilizando el sintetizador de péptidos automatizado Biotage Initiator+ Alstra y resina Wang (malla 100–200, 1,24 mmol g-1), que se hinchó en dimetilformamida (DMF) durante 2 h antes de su uso. Luego se agregaron secuencialmente a la resina los aminoácidos Fmoc y HCTU/HOBt/DIPEA (4 eq.) disueltos en DMF y las reacciones de acoplamiento se llevaron a cabo con calentamiento por microondas a 60 °C durante 20 min. Los grupos protectores Fmoc se eliminaron usando piperidina (20% en DMF) a temperatura ambiente durante 20 min. Los péptidos se escindieron de la resina utilizando una mezcla de 95% de ácido trifluoroacético (TFA) y 5% de triisopropilsilano (TIPS) durante 3 h. Después de la evaporación de la mezcla TFA/TIPS y la precipitación con dietiléter, los péptidos crudos se purificaron usando cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) de fase inversa en el sistema Shimadzu HPLC equipado con dos bombas Shimadzu LC-20AD, un muestreador automático SIL-20AHT, Detector de matriz de fotodiodos SPD-M20A y un colector de fracciones FRC-10A y una columna semipreparativa Onyx Monolithic C18 de 100 × 10 mm con un sistema de disolvente que consta de TFA al 0,1% en agua y acetonitrilo durante 30 minutos. Los péptidos purificados se liofilizaron y almacenaron a -20 °C. Se confirmó que la pureza era> 95% en cada caso mediante HPLC analítica y las estructuras se confirmaron mediante espectrometría de masas de ionización por electropulverización de alta resolución (Figura complementaria 11).

Se reclutó un total de 20 donantes no expuestos y 1 donante triplemente vacunado (VAC62); todos los detalles se proporcionan en la Tabla complementaria 18. Las PBMC se separaron de la sangre completa o de las capas leucocitarias mediante centrifugación en gradiente de densidad. Las PBMC se usaron frescas o se almacenaron criogénicamente hasta su uso. Las PBMC con genotipado HLA de EE. UU. se almacenaron en el Programa Nacional de Donantes de Médula (NMDP)/Be The Match Research Sample Repository (protocolo ClinicalTrials.gov NCT04920474) que se habían recolectado de donantes sanos antes del inicio de la pandemia de COVID-19. Todos los individuos dieron su consentimiento para la investigación y la publicación de los resultados de la investigación y habían sido previamente genotipados para HLA clase I y clase II. La aprobación ética para realizar la investigación se obtuvo del Comité de Ética de Investigación Humana del Instituto de Investigación Médica QIMR Berghofer (P2282) y del Comité de Ética de Investigación Humana de la Universidad La Trobe (HEC21097). El genotipado HLA se realizó mediante AlloSeq Tx17 (CareDx Pty) utilizando getyping de alta resolución AllType NGS en la plataforma IonTorrent NGS.

Cada péptido se cargó en HLA-B*15:01 biotinilado (ya sea hecho a medida o comprado en easYmers immunAware) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Para la tinción combinatoria de tetrámeros que incluía los cuatro péptidos del SARS-CoV-2 (Tabla complementaria 17) relacionados con las figuras 1a a c, se generaron tetrámeros HLA-B*15:01 cargados con péptidos utilizando estreptavidina conjugada con PE, APC, PE. -CF594 o BV421 según instrucciones del fabricante. Posteriormente se añadió d-biotina (500 µM) a cada tetrámero cargado con péptido y los tetrámeros se combinaron justo antes de la tinción celular. Se utilizó tinción combinatoria con tetrámeros para identificar cada epítopo mediante combinaciones únicas de fluoróforos duales donde al menos uno de los fluoróforos contenía PE (Tabla complementaria 17). Las frecuencias de células T específicas de antígeno se calcularon como se describió anteriormente57. En resumen, se utilizó una alícuota de PBMC para teñir y contar la superficie celular utilizando 123count eBeads (Invitrogen). Las PBMC restantes se tiñeron con los grupos de tetrámeros indicados y se enriquecieron usando microperlas magnéticas anti-PE (Miltenyi) sobre una columna magnética, se tiñeron la superficie celular y se contaron como para el enriquecimiento previo. Las células T CD8+ se identificaron seleccionando linfocitos CD8+ singletes vivos que fueron negativos para CD4, CD14, CD16 y CD19 (Figura 2 complementaria y Tabla 19 complementaria). Se utilizó una estricta estrategia de selección de tetrámeros mediante la cual las células T CD8+ marcadas con sólo dos fluoróforos se consideraron específicas de antígeno. El estado de la memoria de las células T CD8+ positivas para tetrámero se determinó por la falta de coexpresión de CCR7 y CD45RA. Dado el bajo número de células disponibles de los donantes, solo las células T tetrámero+CD8+ con frecuencias superiores a 1 × 10−4 por células T CD8+ totales se consideraron positivas.

Para la tinción del tetrámero que incluía solo los péptidos NQK-Q8 y NQK-A8 (relacionados con las Figs. 1d y 2 y Datos ampliados Fig. 1), se generaron tetrámeros HLA-B*15:01 cargados con péptidos usando estreptavidina conjugada con ficoeritrina. (EDUCACIÓN FÍSICA). Las células teñidas con tetrámero se enriquecieron utilizando perlas inmunomagnéticas recubiertas de anticuerpo anti-PE en columnas LS (Miltenyi Biotech) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después del enriquecimiento, las células se tiñeron con un panel de anticuerpos que incluía anti-CD3-BV480 (dilución 1:100), anti-CD8-PerCP-Cy5.5 (1:50), anti-CD4-BV650 (1:100), anti -CD14-APCH7 (1:200), anti-CD19-APCH7 (1:100), anti-CD45RA-FITC (1:100), anti-CD27-APC (1:100), anti-CCR7-PE-Cy7 (1:50), anti-CD95-BV421 (1:50), anti-PD1-BV605 (1:100) (todos BD Biosciences) y tinción de células muertas de infrarrojo cercano fijable viva/muerta (1:1000) (Life Tecnologías) (Figura complementaria 4). Las células se resuspendieron en tampón MACS (PBS, BSA al 0,5%, EDTA 2 mM) y se clasificaron directamente por índice unicelular en placas de PCR (Eppendorf) utilizando el sistema BD Aria Fusion.

Las líneas de células T CD8+ se generaron como se describió anteriormente25,58. En resumen, las PBMC se incubaron con 1 μM de péptido individual (NQK-Q8 o NQK-A8) y se cultivaron durante 10 a 14 días en RPMI-1640 suplementado con una solución de aminoácidos no esenciales de MEM 2 mM (Sigma-Aldrich), 100 HEPES mM (Sigma-Aldrich), l-glutamina 2 mM (Sigma-Aldrich), penicilina-estreptomicina (Life Technologies), 2-ME 50 mM (Sigma-Aldrich) y suero bovino fetal inactivado por calor al 10% (Bovogen). Los cultivos se complementaron con 10 UI de IL-2 2 a 3 veces por semana. Se utilizaron líneas de células T CD8+ frescas para análisis posteriores. Para los experimentos de tinción con tetrámero doble, se tiñeron 0,5 × 106 células de las líneas de células T CD8+ con un único tetrámero conjugado con PE (HLA-B*15:01-NQK-Q8 o HLA-B*15:01-NQK-A8) o teñido doblemente con ambos tetrámeros (NQK-A8 conjugado con PE y tetrámero NQK-Q8 conjugado con APC) durante 1 h a temperatura ambiente. Las células se lavaron y se tiñeron la superficie con anti-CD3-BV480 (dilución 1:100), anti-CD8-PerCP-Cy5.5 (1:50), anti-CD4-BV650 (1:100), anti-CD14- Anticuerpos APCH7 (1:200) y anti-CD19-APCH7 (1:100) (todos BD Biosciences) y tinción de células muertas de infrarrojo cercano fijable viva/muerta (Life Technologies). Las células se clasificaron unicelularmente en placas de PCR (Eppendorf) utilizando el sistema BD Aria Fusion.

Las líneas de células T CD8 + se estimularon con 1 μM del péptido afín u homólogo y se incubaron durante 4 a 5 h en presencia de GolgiPlug, GolgiStop y anti-CD107a-FITC (dilución 1:100) (todos BD Biosciences). Después de la estimulación, las células se tiñeron en superficie durante 30 minutos con anticuerpos anti-CD3-BV480 (1:100), anti-CD8-PerCP-Cy5.5 (1:50) y anti-CD4-BV650 (1:100) (todos BD Biosciences) y tinción de células muertas de infrarrojo cercano fijable viva/muerta (Life Technologies). Las células se fijaron y permeabilizaron utilizando una solución BD Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences) y luego se tiñeron intracelularmente con anti-IFN-γ-BV421 (1:100), anti-TNF-PE-Cy7 (1:100), anti-IL2- Anticuerpos PE (1:100) y anti-MIP-1β-APC (1:100) (todos BD Biosciences) durante 30 minutos más. Las células se adquirieron en el sistema BD FACSymphony A3 utilizando el software FACSDiva (v.9.0.). El análisis posterior a la adquisición se realizó utilizando el software FlowJo (v.10). Los niveles de detección de citoquinas identificados en la condición de control sin péptido se restaron de las condiciones de prueba correspondientes en todos los gráficos de resumen para tener en cuenta la producción espontánea de citocinas no específica.

La PCR múltiple unicelular se realizó como se describió anteriormente59. En resumen, el ADNc se generó utilizando el kit de síntesis de ADNc VILO (Invitrogen) a 1/20 de las recomendaciones del fabricante con Triton X-100 al 0,1%. Posteriormente se llevó a cabo una PCR anidada que comprendía 40 cadenas α y 27 β. Los productos de PCR se purificaron utilizando ExoSAP (GE Healthcare) y se secuenciaron en AGRF. Las secuencias se analizaron utilizando FinchTV (Geospiza v.1.5.0) y el software IMGT60. Las secuencias de CDR3 mostradas son todas productivas (sin codones de parada)61.

Los experimentos de SPR se realizaron a 25 °C en el instrumento BIAcore T200 en Tris-HCl 10 mM, pH 8,0 (Fisher Bioreagents), NaCl 150 mM (Merck), tensioactivo P20 al 0,005 % (Cytiva) y BSA al 0,5 % (Sigma-Aldrich). . Se utilizaron chips de estreptavidina para unir complejos biotinilados HLA-B*15:01-NQK (acoplados a ~4000 unidades de respuesta). La primera celda de flujo se cargó con H2Db-PA (control negativo). Los experimentos se realizaron con diez diluciones en serie de los TCR a partir de 100 o 150 μM. Todos los experimentos se realizaron por duplicado dos veces (n = 2 experimentos independientes). BIAevaluación (v.3.1) y GraphPad Prism 9 (v.9.3) se utilizaron para el análisis de datos informado en la Tabla complementaria 10.

Las secuencias TRA y TRB se analizaron utilizando el paquete de software del Sistema de Información Internacional ImMunoGeneTics (IMGT)62. La nomenclatura del gen V(D)J utilizada es la de la base de datos IMGT (www.imgt.org). Los motivos enriquecidos se identificaron utilizando el software de descubrimiento de motivos de la suite MEME (v.5.5.2.)63. El software MEME elige automáticamente el ancho y el número de apariciones de cada motivo para minimizar el valor E del motivo. Los motivos se buscaron en modo discriminativo y se representaron como logotipos de secuencia, donde los tamaños relativos de las letras indican sus frecuencias en el conjunto de secuencias, y la altura total de las letras representa el contenido de información de la posición, en bits.

Se utilizó GraphPad Prism 9 (v.9.3) para realizar el análisis estadístico. Las comparaciones estadísticas entre grupos se determinaron mediante análisis de varianza unidireccional o bidireccional con corrección para comparaciones múltiples. P <0,05 se consideró significativo.

La cadena pesada HLA-B*15:01, la β2-microglobulina y las cadenas α y β de TCR se expresaron en células BL21 de Escherichia coli como cuerpos de inclusión. HLA-B*15:01 se replegó y purificó como se describió anteriormente61. En resumen, se produjeron complejos solubles HLA-B*15:01–NQK-Q8 o -A8 replegando cuerpos de inclusión en las siguientes cantidades: 30 mg de cadena pesada, 10 mg de β2-microglobulina y 5 mg del péptido en 200 ml de tampón (Tris-HCl 100 mM pH 8,0 (Fisher Bioreagents), l-arginina 400 mM (Sigma-Aldrich), glutatión oxidado 500 µM (Goldbio), glutatión reducido 5 mM (Goldbio), EDTA 20 mM (Sigma-Aldrich )). El gen TRBV7-2 tiene cuatro alelos (TRBV7-2*01 y TRBV7-2*02/03/04), lo que cambia Ser45 a Arg45 aguas arriba del bucle CDR2β y Gly84 a Glu84 del bucle HV464, lo que podría afectar el reconocimiento de pHLA. A partir de los resultados de la secuenciación TCR, no pudimos diferenciar los alelos. Como TRBV7-2*02/03/04 son similares a nivel de proteínas, produjimos los TCR con TRBV7-2*01 o TRBV7-2*02. Los resultados de SPR muestran que el polimorfismo dentro de la cadena β no afectó el reconocimiento de pHLA (Datos ampliados, figuras 7 y 8 y tabla complementaria 10). Los TCR se replegaron mezclando 100 mg de la cadena α y 50 mg de la cadena β en 400 ml del mismo tampón que contenía urea 5 M (Sigma-Aldrich). Las mezclas replegadas se dializaron en Tris-HCl 10 mM, pH 8,0 (Fisher Bioreagents). Los complejos HLA-B*15:01-NQK y los TCR se purificaron mediante cromatografía de intercambio aniónico (DEAE y HiTrap Q, ambos GE Heathcare).

DSF realizó ensayos de estabilidad térmica utilizando el sistema de PCR en tiempo real ViiA 7 (Thermo Fisher Scientific), en el que el complejo HLA-B*15:01-YFP se calentó de 25 a 95 °C a una velocidad de 1 °C. min-1 en pasos de 0,5 °C. Los canales de excitación y emisión se configuraron para el reportero TAMRA (filtro x3m3) con excitación de ~550 nm y detección a ~587 nm. El experimento se realizó a dos concentraciones de pHLA (5 µM y 10 µM) por duplicado. Cada muestra se dializó en Tris-HCl 10 mM, pH 8,0 (Fisher Bioreagents), NaCl 150 mM (Merck) y contenía una concentración final de tinte naranja SYPRO 10X (Invitrogen). Los datos de intensidad de fluorescencia se normalizaron y representaron utilizando GraphPad Prism 9 (v.9.3). El valor de Tm para un pHLA es igual a la temperatura a la que se alcanza el 50% de la intensidad máxima de fluorescencia, que es igual a aproximadamente el 50% de la proteína desplegada y se resume en la Tabla complementaria 9.

Se cultivaron cristales de complejos HLA-B*15:01-péptido mediante difusión de vapor en forma de gota colgante a 20 °C. La relación proteína:gota del depósito fue de 1:1, a una concentración de 3 mg ml-1 en Tris-HCl 10 mM, pH 8 (Fisher Bioreagents), NaCl 150 mM (Merck). Se cultivaron cristales de HLA-B*15:01–NQK-Q8 en formiato de sodio 0,2 M, pH 7,0 y polietilenglicol 3350 al 20 % (p/v); y, para HLA-B*15:01–NQK-A8, en polietilenglicol 3350 al 20 % (p/v) y etilenglicol al 2 % (v/v). Los cristales de proteína se empaparon en una solución crioprotectora que contenía una solución de licor madre con 20% (v/v) de etilenglicol y luego se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido. Los datos fueron recopilados en la línea de luz MX2 en el Sincrotrón Australiano, parte de ANSTO, Australia65. Los datos se procesaron usando XDS66 y las estructuras se determinaron mediante reemplazo molecular usando el programa PHASER (v.2.8.3)67 de la suite CCP468 con un modelo de HLA-B*15:01 sin el péptido (derivado de Protein Data Bank (PDB) 5TXS)69. La construcción manual del modelo se realizó utilizando COOT70 seguido del refinamiento con BUSTER71 y PHENIX (v.1.20.1-4487)72. Los modelos finales se validaron y depositaron utilizando el sistema wwPDB OneDep y las estadísticas de refinamiento finales y los códigos PDB se resumen en la Tabla de datos extendida 2. Todas las representaciones gráficas moleculares se crearon usando PyMOL (v.2.5).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todos los datos fenotípicos y de HLA para las cohortes de Ciencia Ciudadana y CHIRP/LIINC y del Reino Unido están disponibles en la base de datos pública en línea (http://www.hlacovid19.org/database/; Proyecto 3 Hollenbach y Proyecto 6 Langton). Las estructuras de cristalografía están disponibles en el PDB con los códigos de acceso 8ELG y 8ELH para HLA-B*15:01–NQK-A8 y HLA-B*15:01–Q8, respectivamente.

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Agradecemos a los miles de voluntarios que donaron médula ósea y que se tomaron el tiempo de participar en este estudio; el personal de las instalaciones de Citometría de Flujo de las Universidades La Trobe y Monash; N. Faramaz por su ayuda con el análisis de la secuencia del TCR; y D. Jayasinghe por su asistencia técnica. Este estudio fue financiado por las subvenciones R01AI159260, 3U2CEB021881-05S1 y R21HG012386 de los Institutos Nacionales de Salud; el Consejo Nacional de Investigación Médica y de Salud (NHMRC); Fondo para el futuro de la investigación médica (MRFF2005654 a SG); NHMRC SRF (1159272 a SG); y beca de estipendio del Programa de Capacitación en Investigación (RTP) (para LDM). El CIBMTR cuenta con el apoyo principalmente del Servicio de Salud Pública U24CA076518 del Instituto Nacional del Cáncer (NCI), el Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre (NHLBI) y el Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas (NIAID); HHSH250201700006C de la Administración de Recursos y Servicios de Salud (HRSA); y N00014-20-1-2832 y N00014-21-1-2954 de la Oficina de Investigaciones Navales. También brindan apoyo la Fundación Be the Match, el Colegio Médico de Wisconsin y el Programa Nacional de Donantes de Médula. Las opiniones expresadas en este artículo no reflejan la política o posición oficial del Instituto Nacional de Salud, el Departamento de la Marina, el Departamento de Defensa, la Administración de Recursos y Servicios de Salud (HRSA) o cualquier otra agencia del gobierno de los EE. UU.

Los siguientes autores contribuyeron igualmente: Danillo G. August, Lawton D. Murdolo, Demetra SM Chatzileontiadou

Estos autores supervisaron conjuntamente este trabajo: Stephanie Gras, Jill A. Hollenbach

Instituto Weill de Neurociencias, Departamento de Neurología, Universidad de California, San Francisco, CA, EE. UU.

Danilo G. Augusto, Joseph J. Sabatino Jr., Tasneem Yusufali, Kerry Kizer, Karoline Guthrie y Jill A. Hollenbach

Departamento de Ciencias Biológicas, Universidad de Carolina del Norte en Charlotte, Charlotte, Carolina del Norte, EE. UU.

Danillo G. Augusto

Programa de Postgrado en Genética, Universidad Federal de Paraná, Curitiba, Brasil

Danillo G. Augusto

Departamento de Bioquímica y Química, Instituto La Trobe de Ciencias Moleculares, Universidad La Trobe, Bundoora, Victoria, Australia

Lawton D. Murdolo, Demetra SM Chatzileontiadou, Michael J. Dewar-Oldis, Peter J. Barnard y Stephanie Gras

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Instituto de Descubrimiento de Biomedicina, Universidad de Monash, Clayton, Victoria, Australia

Demetra SM Chatzileontiadou y Stephanie Gras

División de Cardiología, Departamento de Medicina, Universidad de California, San Francisco, CA, EE. UU.

Noah D. Peyser, Xochitl Butcher, Gregory M. Marcus y Jeffrey E. Olgin

División de VIH, Enfermedades Infecciosas y Medicina Global, Departamento de Medicina, Universidad de California, San Francisco, CA, EE. UU.

Victoria W. Murray, Vivian Pae, Sannidhi Sarvadhavabhatla, Fiona Beltran, Gurjot S. Gill, Michael J. Peluso, Rebecca Hoh, Steven G. Deeks y Sulggi Lee

Departamento de Medicina de Laboratorio, Universidad de California, San Francisco, CA, EE. UU.

Kara L. Lynch y Cassandra Yun

Instituto de Ciencias Clínicas y Traslacionales, Universidad de Utah, Salt Lake City, UT, EE. UU.

Colin T. Maguire

División de Medicina Experimental, Departamento de Medicina, Universidad de California, San Francisco, CA, EE. UU.

Timothy J. Henrich

Departamento de Medicina, Universidad de California, San Francisco, CA, EE. UU.

michelle davidson

Departamento de Epidemiología y Bioestadística, Universidad de California, San Francisco, CA, EE. UU.

Scott Lu, Sarah A. Goldberg, J. Daniel Kelly, Jeffrey N. Martin, Mark J. Pletcher y Jill A. Hollenbach

Fundación FI Proctor, Universidad de California, San Francisco, CA, EE. UU.

J. Daniel Kelly

CIBMTR (Centro para la Investigación Internacional de Trasplantes de Sangre y Médula Médula), Programa Nacional de Donantes de Médula Médula/Be The Match, Minneapolis, MN, EE. UU.

Cynthia A. Vierra-Green, Stephen R. Spellman y Martin Maiers

ExplantLab, Newcastle upon Tyne, Reino Unido

David J. Langton

Centro QIMR Berghofer de Inmunoterapia y Desarrollo de Vacunas Brisbane, Instituto de Investigación Médica QIMR Berghofer, Brisbane, Queensland, Australia

Corey Smith

División de Medicina Interna General, Universidad de California, San Francisco, CA, EE. UU.

Mark J. Pletcher

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JAH, DGA, SG, DSMC, LDM y MM concibieron este trabajo. JAH, DGA, JJS, SG, DSMC, LDM, GMM, JEO, MJ Pletcher., NDP y MM desarrollaron la metodología. JAH, DGA, JJS, SG, DSMC, LDM y KG llevaron a cabo el análisis formal. JAH, DGA, JJS, SG, DSMC y LDM llevaron a cabo las investigaciones. JAH, PJB, CS, SG, CAV-G., SRS, DJL, S. Lee., MM, GMM, JEO y MJ Pletcher. recursos obtenidos. JAH, DGA, SG, DSMC, LDM, TY, NDP, XB, KK, VWM, VP, SS, FB, GSG, KLL, CY, CTM, MJ Peluso., RH, TJH, SGD, MD, S. Lu. , SAG, JDK, JNM, CAV-G., SRS, DJL, MJD-O., CS, S. Lee., GMM, JEO y MJ Pletcher. llevó a cabo la recolección de muestras y la curación de datos. JAH, DGA, JJS, SG, DSMC, LDM y MJD-O. eran responsables de la visualización. JAH, SG, DSMC y S. Lee. obtuvo financiación. JAH y SG llevaron a cabo la administración del proyecto. JAH, SG, DSMC y PJB fueron responsables de la supervisión. JAH, DGA, JJS, SG, DSMC y LDM escribieron el borrador original. Todos los autores revisaron y editaron el manuscrito final.

Correspondencia a Jill A. Hollenbach.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature agradece a Donald Vinh, Lawrence Stern y los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

(a – b) Gráficos FACS individuales para cada muestra de donante prepandémica utilizada para la tinción de tetrámero ex vivo después del enriquecimiento magnético del tetrámero con tetrámero tet-A8 (a) y con tetrámero tet-Q8 (b), de 5 y 7 donantes, respectivamente . Las células T CD8+ tetrámero+ enriquecidas observadas se indican dentro del cuadrado interior.

( a, b ) Gráficos FACS de células T CD8 + tetrámero NQK-A8 + después del enriquecimiento magnético del tetrámero ( a ) y células T CD8 + tetrámero NQK-Q8 + ( b ). Las células T CD8+ tetrámero+ NQK-A8- y NQK-Q8- que se muestran como puntos azules se representaron frente a las células T CD3+ que se muestran como puntos grises y se controlaron en CCR7 y CD45RA para determinar el estado de la memoria, luego del enriquecimiento magnético del tetrámero para cada donante. (c) El porcentaje de tetrámero+ de células T CD8+ después del enriquecimiento magnético del tetrámero se informa para cada donante con la barra violeta para el tetrámero Tet-Q8 y la barra naranja para el tetrámero Tet-A8 (n = 7 y n = 6 biológicamente independientes muestras, respectivamente). Los datos se presentan como valores medianos con IQR (rango intercuartílico). El porcentaje individual de cada donante se indica en los paneles a y b. (d) La proporción de Tnaïve (CD45RA+CCR7+CD95-); TSCM (memoria de células madre, CD45RA+CCR7+CD95+); TCM (memoria central, CD45RA-CCR7+); TEM (memoria efectora, CD45RA-CCR7-); Células TEMRA (terminalmente diferenciadas, CD45RA+CCR7-) en diferentes donantes.

Se determinó la frecuencia de células T CD8+ con diferentes funciones efectoras (IFNγ, TNF, IL-2, MIP-1β, CD107a), junto con el número de funciones diferentes, menos el control sin péptido. El anillo exterior del pastel de doble anillo muestra el perfil de función en diferentes colores según la tabla, y el anillo interior representa el número de funciones con negro para 5 y blanco para 1.

Mapas de calor que muestran el uso preferido de TRAV (izquierda) y TRBV (derecha) de TCR específicos de péptidos NQK-Q8-, NQK-A8- o ambos (dobles) en todos los donantes no expuestos en conjunto.

Resumen de las longitudes de CDR3α (izquierda) y CDR3β (derecha) y el análisis de motivos para los clonotipos de TCR específicos de NQK-A8 (arriba), NQK-Q8 (centro) y ambos péptidos (abajo) en donantes no expuestos. El programa de descubrimiento de motivos MEME se utilizó para identificar motivos enriquecidos; el tamaño relativo de cada símbolo residual es proporcional a su frecuencia, mientras que la altura total de los símbolos aa indica el contenido de información de la posición en bits. El motivo en el panel superior izquierdo es el motivo de secuencia larga de 13 aminoácidos (aa) de CDR3α derivado de todas las secuencias de CDR3α obtenidas (n = 165); en el panel superior derecho está el motivo de secuencia larga CDR3β 16 aa derivado de todas las secuencias de CDR3β obtenidas (n = 220).

(a–b) Estructuras de HLA-B*15:01-NQK-Q8 (péptido como enfermedad púrpura) (a) y HLA-B*15:01-NQK-A8 (péptido como barra de naranja) (b), con la cadena HLA en caricatura blanca. (c – d) Mapa de densidad electrónica alrededor de los péptidos NQK-Q8 (palo morado) y NQK-A8 (palo naranja), respectivamente, en verde a 3 s para el mapa Fo-Fc. (e – f) Mapa de densidad electrónica alrededor de los péptidos NQK-Q8 (palo morado) y NQK-A8 (palo naranja), respectivamente, en azul en 1s para el mapa 2Fo-Fc. ( g – h ) Análisis del factor B de los átomos de los péptidos NQK-Q8 y NQK-A8, respectivamente. Los átomos están coloreados según su factor B que indica la movilidad de cada átomo de bajo (azul) a alto (rojo).

Sensogramas SPR para los 5 TCR probados y cada curva muestra una concentración diferente del TCR.

Curva de unión en estado estacionario para los cinco TCR analizados hacia el complejo HLA*15:01-NKQ-Q8 o -A8. Los analitos (TCR) fluyeron sobre HLA*15:01-NKQ-Q8 o -A8 inmovilizado con un rango de concentración de 0 a 100 μM. n = 2 experimentos biológicamente independientes realizados por duplicado, y el gráfico muestra los resultados de un experimento.

Este archivo contiene Figs complementarias. 1–11.

Este archivo contiene las tablas complementarias 1 a 19.

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Reimpresiones y permisos

Augusto, DG, Murdolo, LD, Chatzileontiadou, DSM et al. Un alelo común de HLA se asocia con la infección asintomática por SARS-CoV-2. Naturaleza 620, 128-136 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-06331-x

Descargar cita

Recibido: 10 de octubre de 2022

Aceptado: 15 de junio de 2023

Publicado: 19 de julio de 2023

Fecha de emisión: 03 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-06331-x

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